这些问题促使研究人员重新研究哺乳动物细胞中的DNA 6mA。为了提供可靠的数据，该研究开发的无污染UHPLC-MS / MS技术用于哺乳动物中6mA的超灵敏和准确检测。该研究在四种培养的哺乳动物细胞系中测量了基因组6mA。

研究人员在三种人类细胞系中观察到6mA电流信号，包括HEK293T细胞，人间充质干细胞和人类胚胎干细胞（hESC），另外研究人员还在mESC中检测到6mA。通过特异性PCR分析检测到，在所有这些培养细胞中均未观察到支原体污染。通过使用早期的G1期阻滞palbociclib，研究人员观察到6mA的适度增加，这是第一次报告了G1期中6mA的累积。

接下来，研究人员利用独特的稳定同位素标记的脱氧腺苷示踪技术来研究6mA的起源。先前的研究表明[15N5] -2′-脱氧腺苷（[15N5] -dA）示踪剂可以[15N4] -dA的形式掺入基因组DNA中。如果在任何培养的细胞中都存在依赖于甲基转移酶的6mA ，应检测到[15N4] -6mA。尽管对dA进行了有效标记，但该研究未能在包括mESC，hESC和HEK293T细胞在内的三种测试细胞系中所有细胞周期阶段检测到任何[15N4] -6mA信息。此外，在六个培养条件下，该研究没有在mES细胞的基因组中检测到任何[15N4] -6mA。为了证实结果，研究人员使用了第二种稳定的同位素标记试剂[13CD3] L-蛋氨酸。该化学物质可在体内转化为稳定的同位素标记的甲基供体S-腺苷-L-蛋氨酸，必须通过可能的6mA甲基化酶利用它来生成DNA N6-甲基化的腺嘌呤。如果有任何甲基转移酶作用于dA的N6原子，可以检测到形成的[13CD3] -6mA。与上述结果一致，研究人员在所有细胞周期阶段均未在处理过的mES细胞中检测到任何[13CD3] -6mA。总的来说，以上所有结果支持观察到的6mA独立于甲基化酶，证明了不依赖于甲基化酶的6mA。

现在的问题是mES细胞6mA怎么整合进基因组。为了回答这个问题，研究人员首先探索了常规使用的高保真Taq DNA聚合酶，以替代哺乳动物细胞中依赖模板的高保真复制聚合酶。通过用N6-甲基-dATP（N6mdATP）取代2′-脱氧腺苷三磷酸（dATP），该研究观察到6mA掺入PCR产物中。但是，当使用比例为1：1000的N6mdATP和dATP的混合物进行PCR扩增时，研究人员无法观察到任何6mA掺入。这些结果表明，高保真聚合酶更喜欢使用dATP而不是N6mdATP进行DNA合成。与非同步细胞相比，G1期mES细胞晚期Polλ的mRNA表达增加。Polλ敲低有效降低了非同步和晚期G1期细胞的mRNA表达和6mA丰度。研究人员进一步产生了两个Polλ基因敲除mES细胞系。研究人员用 L-mimosine处理细胞以获得G1期占优势的细胞，并观察到polλ的缺失降低了6mA的丰度。

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